Microscopios-Discos de Airy

Punto de propagación en los discos

Es importante tener en cuenta que la imagen que se observa a través del objetivo no es un punto de imagen del objeto, por ejemplo, un diminuto orificio en la lámina metálica como un disco brillante con bordes bien definidos; sino, como un punto rodeado de anillos de difracción ligeramente borrosos, llamados discos de Airy, (figura A).

En la imagen tridimensional del patrón de difracción cerca del plano de imagen intermedio que se conocen como la función de punto de propagación, (figura B). Un disco de Airy es la región encerrada por el primer mínimo de la pauta aireado y contiene aproximadamente el 84% de energía luminosa, como se representa en la figura C; la función de punto de propagación es una representación tridimensional del disco. 

La resolución se puede calcular con la fórmula desarrollada por Ernst Abbe a finales del siglo XIX, y representa una medida de nitidez en la imagen de un microscopio de luz.

(A) Resolución x, y = λ / 2 [η • sen (α)]     (B) Resolución z = 2 λ / [η • sen (α)] 

Donde λ es la longitud de onda de la luz, η representa el índice de refracción del medio de formación de imágenes como se describe anteriormente, y el combinado término η • sen (α) se conoce como la apertura numérica objetiva, AN. En microscopía, los objetivos utilizados comúnmente suelen tener una apertura numérica que es menor de 1,5, lo que restringe el término α en las ecuaciones (A) y (B) a menos de 70º, aunque nuevos objetivos de alto rendimiento se aproximan estrechamente este límite.

Disco_AiryEl límite teórico de resolución en la longitud de onda práctico más corto, (aproximadamente 400 nm.) es aproximadamente de 150 nm. en la dimensión lateral, y acercándose a 400 nm. en la dimensión axial, cuando se utiliza un objetivo que tiene una apertura numérica de 1,40.

Las estructuras que se encuentran más cerca de esta, no pueden resolverse en el plano lateral de un microscopio, debido al interés de la interrelación central entre el índice de refracción de la imagen del medio y la abertura angular del objetivo; Abbe introdujo el concepto de apertura numérica en su explicaciones sobre la resolución del microscopio.

Disco de Airy

Los anillos de difracción en el disco de Airy son causados por la función de limitación de la apertura del objetivo de tal manera que el objetivo actúa como un agujero, detrás de la cual se encuentran anillos de difracción. Cuanto mayor sea la abertura del objetivo y del condensador, la más pequeña será 0. Por consiguiente, cuanto mayor sea la apertura numérica del sistema total, mejor es la resolución. 

Una de las ecuaciones relacionadas con la fórmula original de Abbe han derivado para explicar la relación entre la apertura numérica, la longitud de onda, y la resolución.

Resolución x, y o d 0 = 1.22  λ / [ AN Obj + AN Con ]

Donde λ (Lambda) es la longitud de onda de la luz de imagen, AN Condensador es la apertura numérica del condensador, y AN Objetivo es igual a la apertura numérica objetiva. El factor 1,22 se ha tomado del cálculo para el enfoque de cerca de dos discos donde se han superpuesto los perfiles de intensidad. Si los dos puntos de imagen están muy lejos uno de otro, son fáciles de reconocer como objetos independientes.

Microscopio zeiss LSM 880 con Airyscan

Microscopio Zeiss LSM 880 con Airyscan

Confocal o de barrido láser, escanea muestras de forma secuencial punto a punto. Se obtienen imágenes de planos ópticos del espécimen con un alto contraste y alta resolución.

Sin embargo, cuando la distancia entre los discos se reduce cada vez más se alcanza un punto límite, cuando el máximo principal del segundo disco coincide con el primer mínimo del primer disco. Los perfiles superpuestos muestran dos brillos máximos que están separados por un valle. La intensidad en el valle se reduce en un 20% aproximadamente en comparación con los dos máximos. Esto es suficiente para que el ojo del observador pueda ver dos puntos separados, un límite que se conoce como el criterio de Rayleigh.

Criterio de RayleighCRITERIO DE RAYLEIGH

Propuesta desarrollada por John William Strutt Rayleigh, (1842-1919) físico británico y miembro de la Real Sociedad de Londres. Célebre por su explicación del color azul del cielo como fenómeno de difracción de la luz sobre las moléculas del aire.

Expone que dos líneas espectrales son todavía distinguibles si el máximo de uno coincide con el primer mínimo del otro. La característica esencial de este criterio es que las franjas son precisamente resolubles cuando la irradiancia combinada de ambas franjas en el centro o punto de silla de la franja ancha resultante es 8 / π^ 2 veces el máximo de la irradiancia, quiere decir, que se vería una franja ancha brillante con una región central gris.

Irradiancia 

Es la magnitud utilizada para describir la potencia incidente por unidad de superficie de todo tipo de radiación electromagnética.

El principal factor en la determinación de resolución es la apertura numérica objetiva, pero la resolución también depende del tipo de muestra, la coherencia de la iluminación, el grado de corrección de la aberración, y otros factores tales como la metodología de mejora del contraste, ya sea en el sistema óptico del microscopio o en la propia muestra.

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