Microscopio confocal o láser de barrido

ZEISS LSM 800 for materialsEn microscopía fotónica convencional, el tejido de la muestra debe diseccionarse sutilmente para su examen, y mientras más fino sea más nítida será la imagen; pero se pierde información tridimensional durante su disección.

Microscopio Zeiss confocal  LSM 800 213 g

En un microscopio fotónico al observar muestras grandes, la imagen enfocada se aprecia contaminada por la superposición de los elementos del tejido que están fuera del plano enfocado; las imágenes se ven difusa y debilitadas por las estructuras superpuestas desenfocadas.

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Estas limitaciones son resueltas en un microscopio confocal que permite realizar cortes ópticos finos a muestras de tejidos de distinto tamaño y realizar reconstrucciones en 3D a partir de cortes seriados.

El científico estadounidense Marvin Lee Minsky, (1927-2016) fue el inventor del microscopio confocal en 1957. Su estructura basada en el microscopio de fluorescencia permite obtener imágenes tridimensionales de células y tejidos.

En un microscopio óptico de fluorescencia de campo ancho convencional, la fluorescencia secundaria emitida por la muestra a menudo se produce a través del volumen excitado y oscurece la resolución de las características que se encuentran en el plano focal objetivo. El problema se agrava en especímenes más gruesos, que suelen exhibir un grado altísimo de emisión de fluorescencia donde se pierde la mayor parte de los detalles finos.

Microscopio-confocal

Microscopio confocal laser, Olympus FV1000

El microscopio confocal, posee una óptica compleja y sistemas electrónicos e informáticos que permiten enfocar un plano determinado del espécimen, eliminando la fluorescencia procedente de las zonas que no están en el plano de enfoque. La clave básica para el enfoque confocal, es el uso de técnicas de filtrado espacial para eliminar la luz fuera de foco, o el deslumbramiento en especímenes cuyo grosor excede el plano de enfoque inmediato.

Imágenes que comparan los campos de visión en el campo ancho tradicional y la microscopía confocal de fluorescencia de exploración por láser.

microscopía confocal_fluorescencia y de campo anchoA: Sección gruesa de médula humana manchada de fluorescencia en un microscopio de fluorescencia de campo ancho, muestra una gran cantidad de reflejo de estructuras fluorescentes por encima y por debajo del plano focal.

D: Cuando se visualiza con un microscopio confocal de barrido láser, la sección gruesa del bulbo revela un grado significativo de detalle estructural.

B: Del mismo modo, la imagen de fluorescencia de campo ancho de fibras musculares de conejo enteras y teñidas con fluoresceína, producen imágenes borrosas que carecen de detalle, mientras que el mismo campo de muestra revela una topografía altamente estriada en microscopía confocal.

C: La autofluorescencia en un grano de polen de girasol produce un contorno diferente de la morfología externa básica, pero no aporta información de la estructura interna.

F: Por el contrario, una leve sección óptica del mismo grano conseguida con técnicas confocales, muestra una diferencia nefasta entre el núcleo de partícula y la envoltura circundante.

La microscopía confocal ofrece varias ventajas sobre la microscopía óptica de campo ancho convencional, incluida la capacidad de controlar la profundidad de campo, la eliminación o la reducción de información de fondo, lejos del plano focal (degradación de la imagen) y la capacidad de recopilar secciones ópticas en series de especímenes gruesos.

Representación láser confocal

  • A: Representaciones de barrido láser confocal para visualizar los tintes de fluorescencia y propiedades de reflexión del tejido aislado de la retina.
  • B: Se lanza un rayo láser a través de un espejo dicroico y un objetivo para excitar el tinte fluorescente en el espécimen.
  • C: La luz fluorescente emitida se conduce hacia atrás y a través del objetivo y un espejo dicroico (trabajado como un filtro de luz) hacia el detector de luz.

Se pueden obtener imágenes de muy alta calidad a partir de especímenes preparados para microscopía convencional de fluorescencia y el creciente número de aplicaciones en biología celular que se basan en imágenes de células fijas y células vivas y tejidos; de hecho, la tecnología confocal está demostrando ser uno de los avances más importantes alcanzados en microscopía óptica.

Configuración microscopía confocal

La luz uniforme emitida por el sistema láser (fuente de excitación) pasa a través de un orificio (abertura) situado en un plano conjugado (confocal) con un punto de escaner de la muestra y un segundo orificio situado delante del detector (tubo fotomultiplicador). 

A medida que el láser es reflejado por un espejo dicromático y escaneado a través del espécimen en un plano focal establecido, la fluorescencia secundaria emitida desde los puntos de la muestra (en el mismo plano focal) pasa de nuevo a través del espejo dicromático y se enfoca como un punto confocal en la abertura del detector.

Configuración óptica y esquema de funcionamiento de láser de microscopio confocal

Configuración y funcionamiento láser en un microscopio confocal

La cantidad de emisión de fluorescencia que sucede, en los puntos por encima y por debajo del plano focal del objetivo no es confocal en el orificio (rayos de luz fuera de foco) y forma discos de Airy extendidos en el plano de la abertura. Una pequeña fracción de emisión de fluorescencia fuera de foco, se suministra a través de la abertura del orificio, la mayor parte de esta luz distinta, no es detectada por el fotomultiplicador y no contribuye a la imagen resultante.

El espejo dicromático, el filtro de barrera y el filtro de excitación, desempeñan funciones similares en los componentes idénticos que en un microscopio de fluorescencia de fluorescencia de campo ancho. Enfocando el objetivo en un microscopio confocal, cambia los puntos de excitación y emisión de un espécimen a un nuevo plano que se vuelve confocal, con las aberturas de los orificios de la fuente de luz y del detector.

Unidad de escáner de microscopio confocal

Unidad de escáner de un microscopio confocal

En microscopía de fluorescencia de fluorescencia de campo ancho tradicional, la muestra se somete a una iluminación intensa por una lámpara de descarga de arco de mercurio o xenón y la imagen de emisión de fluorescencia secundaria puede verse directamente en los oculares o proyectarse sobre la superficie o plano de película tradicional. Las múltiples fuentes de excitación láser, consiste en un cabezal de exploración con componentes ópticos y electrónicos, detectores electrónicos (usualmente fotomultiplicadores) y sistemas informáticos para el procesamiento, análisis y visualización de imágenes.

Aplicaciones

  • En investigaciones en biología celular y biomedicina para medir procesos dinámicos.
  • Realizar vídeos para capturar secuencias en muy corto tiempo en células vivas y otras aplicaciones.
  • En procesos celulares para medir actividades enzimáticas, reacciones de oxidación, pH intracelular, fagocitosis, apoptosis, comunicaciones intercelulares y electrofisiología.
  • Estudios de ADN y ARN.
  • Morfología de organoides citoplasmáticos.
  • Cirugía y otros métodos clínicos.
  • Aplicaciones en la física, química y tecnología alimentaria.
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