Microscopio de fluorescencia de excitación con dos fotones

Es una técnica de representación de fluorescencia que permite la representación del tejido vivo hasta una profundidad aproximada de un milímetro. Siendo una variante del microscopio de fluorescencia multifotón, utiliza la luz de excitación roja cambiada que puede excitar tintes fluorescentes. Sin embargo para cada excitación, dos fotones de la luz infrarroja se absorben.

Microscopía de 2 fotones de excitación

En algunos casos, la excitación de dos fotones puede ser una alternativa viable a la microscopía confocal, debido a su más profunda penetración del tejido y fototoxicidad reducida. El uso de luz infrarroja tiende a dispersarse en el tejido. Debido a la absorción del multifotón la imagen de fondo se suprime fuertemente. Ambos efectos llevan a una profundidad de la penetración aumentada para estos microscopios.

Microscopio_multofotón_excitaciónEsquema de excitación de fluorescencia

Distribución teórica de la luz fluorescente un punto similar a la estructura (punto de propagación) al (campo amplio) microscopía de fluorescencia normal, microscopía de dos fotones, y microscopía confocal, la parte superior del plano focal, hacia abajo a lo largo del eje óptico.

Izquierda:

En modo convencional, la luz de excitación (azul) en la muestra (gris) no solo causa fluorescencia (verde) en la muestra, sino también por encima y por debajo.

Derecha:

En la excitación de fluorescencia multifotónica, la creación de fluorescencia se limita al foco.

Diagrama de microscopio de excitación de dos fotones

CONCEPTO

La excitación de dos fotones, está basado en el criterio de que dos fotones de energía inferior, de forma necesaria para una excitación del fotón, también pueden excitar un fluoróforo (componente de una molécula que hace que ésta sea fluorescente) en una situación cuántica. Cada fotón lleva aproximadamente la mitad de energía necesaria para excitar la molécula.

Una excitación causa la emisión inmediata de un fotón de fluorescencia, normalmente con energía más alta que alguno de los dos fotones excitatorio. La probabilidad de la absorción simultánea de dos fotones es muy baja. Por lo tanto, se requiere regularmente un flujo alto de fotones de excitación, por lo general un láser femtosecond (láser de alta energía).

La excitación se restringe al volumen mínimo focal ~1 femtolitro, (fl: es una unidad de medida de volumen igual a 10-15 litro) ocasionando un alto grado del rechazo de objetos desenfocados. Esta situación de excitación es la clave comparado con microscopios de excitación de un solo fotón, que tienen que emplear elementos adicionales como orificios para apartar la fluorescencia desenfocada.

Esquema de excitación de fluorescencia

Esquema de excitación de fluorescencia

  • Izquierda: en modo convencional, la luz de excitación (azul) en la muestra (gris) no solo causa fluorescencia (verde) en la muestra, sino también por encima y por debajo.
  • Derecha: en la excitación de fluorescencia multifotónica, la generación de fluorescencia se limita al foco.

La fluorescencia de la muestra es recogida por un detector de alta sensibilidad similar a un tubo fotomultiplicador. Esta intensidad de luz observada, se forma en un pixel a la imagen ocasional; el foco explora en todas las direcciones de una zona determinada de la muestra para formar todos los píxeles de la imagen. El espectro de absorción de dos fotones de una molécula puede variar considerablemente de su equivalente con un solo fotón.

Excitación con dos fotones

Para objetos muy finos como células aisladas, el fotón unico (confocal) puede producir imágenes con la resolución óptica más alta debido a sus longitudes de onda de excitación más cortas. En el tejido que se dispersa, por otra parte, el seccionamiento óptico superior y las capacidades del microscopio de dos fotones causan mejor rendimiento.

Anuncios

Responder

Introduce tus datos o haz clic en un icono para iniciar sesión:

Logo de WordPress.com

Estás comentando usando tu cuenta de WordPress.com. Cerrar sesión / Cambiar )

Imagen de Twitter

Estás comentando usando tu cuenta de Twitter. Cerrar sesión / Cambiar )

Foto de Facebook

Estás comentando usando tu cuenta de Facebook. Cerrar sesión / Cambiar )

Google+ photo

Estás comentando usando tu cuenta de Google+. Cerrar sesión / Cambiar )

Conectando a %s